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    毕业论文关键词:帕金森病; 斑马鱼; 突变型; 野生型; 基因测序; 探针; 原位杂交;

    Keywords:  Parkinson's disease (PD) ;zebrafish ;  mutant ;  wild type ;  sequencing ;  probe ;  in situ hybridization;

    引言 5

    1. 斑马鱼的PD模型 5

    2. RNA-seq技术 7

    3. 原位杂交 7

    3.1 实验原理 7

    3.2 实验试剂 7

    3.3 准备:胚胎获取与固定脱水 8

    3.4 原位杂交(3-4天) 9

    3.4.1 Day1:重新水化、固定、酶解、预杂交 9

    3.4.2 Day2:探针杂交 10

    3.4.3 Day3:探针回收与抗体孵育 11

    3.4.4 Day4:显色 11

    3.5 原位杂交结果图像采集: 11

    3.6 过染脱色: 11

    3.7 原位杂交后样本后续实验:冰冻切片 12

    4. 结果 12

    5. 讨论 14

    5.1胚胎易破碎 15

    5.2染色背景过高 15

    5.3染色呈蓝绿色或无染色 15

    5.4染色只在表面 15

    6. 前景 15

    参考文献 16

    引言

    帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种最常见的神经退行性运动障碍疾病,该病的临床特征是静止性震颤,肌肉强直,躯体麻痹,随着年龄的增加症状逐渐加重,经多巴胺的前体左旋多巴(L-dopa)治疗后症状减轻。PD 的病理学特征为黑质致密部多巴胺能神经元缺失,以及在剩余的多巴胺能神经元中出现泛素阳性的Lewy小体[ ]。在年龄大于 50 岁的人群中,PD 的发病率大约为 0.30%[ ]。 

    LRRK2的基因定位和克隆起始于日本的一个常染色体显性遗传的 PD 家系.通过对该家系进行全基因组扫描和单体型分析,将 PD 相关的基因定位于 12p11.2~q11.3 13.6cM 的区间内.这个 PD相关位点与已经发现的位点不同,是一个新的位点,被命名为 PARK8[ ].随后,在两个白种人家系中进一步证实PARK8 位点与常染色体显性遗传的 PD相关[ ].最后,在 PARK8 位点内的 LRRK2 基因中检测到与PD 连锁的突变,证实 LRRK2 是 PD的相关基因。LRRK2全称为 leucine-rich repeat kinase 2,其蛋白质多达2 527个氨基酸,包含 ANK、LRR、Roc、COR、Kinase 和 WD40 等多个结构域。在这 6 个结构域中,Roc表现为 GTP 酶活性,Kinase表现为 ATP 激酶活性.ANK、LRR、WD40 均是由重复结构组成的结构域,可介导蛋白质相互作用[ ]。COR的具体功能还不清楚,在 Roc所属的ROCO 蛋白质家族中总是与 Roc串联在一起。LRRK2结构的复杂性指示 LRRK2 具有多样的细胞生物学功能。近年来,LRRK2 的研究已取得了较大进展。

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