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1.7.2 生物防霜 10
1.8 绿色荧光蛋白GFP在基于冰晶核蛋白构建的细胞表面展示体系中的应用 10
1.9 本课题的研究目的和意义 11
2 材料与方法 12
2.1 实验材料 12
2.1.1菌株和质粒 12
2.1.2材料与试剂 13
2.1.3仪器设备 14
2.2 实验方法 14
2.2.1 PCR扩增目的基因 14
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 15
2.2.3 PCR产物纯化 15
2.2.4 T载体连接 15
2.2.5 大肠杆菌的转化 16
2.2.6大肠杆菌质粒的提取 16
2.2.7 酶切、酶连 17
2.2.8 DNA体外重组 18
2.2.9 绿色荧光蛋白（GFP）荧光活性的测定 18
3 结果与分析 19
3.1 质粒提取 19
3.2 PCR扩增inaQ-N序列 19
3.3冰晶核蛋白编码基因inaQ序列分析 20
3.4 PCR产物纯化 20
3.5 T载体连接与导入MG1655 20
3.6 重组质粒pMB104的构建 21
3.7将重组质粒导入大肠杆菌 23
3.8荧光强度测定 24
4 讨论 25
4.1 进行T载体连接的优点 25
4.2 转化过程中的注意事项 25
5 总结 26
附录1 inaQ-N基因片段DNA序列 27
附录2 inaQ-N编码氨基酸序列 27
致谢 28
参考文献 29
缩略语表
英文缩写 全称 中文名
aa Amino acid 氨基酸
Amp Ampicillin 氨苄青霉素
bp base pair 碱基对
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸
GFP Green fluorescent protein 绿色荧光蛋白
h Hour 小时
IPTG Isopropy1-β-D-l-thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
min Minute 分钟
OD Optical density 光密度
PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液
PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
SDS Sodium dodecylsulphate 十二烷基磺酸钠
FRET Fluorescence resonance energy transfer 荧光共振能量转移现象
1 绪论
1.1 绿色荧光蛋白的发现与研究进展
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）具有易于检测、灵活度高、荧光性质稳定、对细胞无毒害、构建载体方便、可直接用于活细胞检测、不受假阳性干扰、易于得到突变体和具有广谱性等优点[1]。2008年10月8日，美籍日裔科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁•沙尔菲（Martin Chalfie）和美国华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖,极大地推动了绿色荧光蛋白在各领域中的应用。1962年，Shimomura等[2]在对多管水母发光蛋白的研究过程中，称另发现一种在日光下略显绿色，在白织灯下略显黄色，在紫外线下发出强烈的绿色荧光的蛋白，并随后研究了其发光特性。然而，Shimomura本人对GFP的应用前景并不感兴趣，直到1988年，沙菲尔在得知GFP之后，大胆的将GFP技术应用到他所在研究的关于C. elegans的研究中去，从此开启了GFP在生物示踪领域的应用。在此后的研究中，沙菲尔发现GFP在植物细胞中的表现频率并不高，由此便萌生了对GFP进行改进的想法[3]。随着生物工程理论与技术的快速发展，GFP的应用领域也在逐步向外拓展，美籍华裔科学家钱永健进一步改进了GFP基因,使得不同的GFP产生的荧光颜色覆盖了整个可见光光谱，同时他改善了生色基团，增强了GFP的荧光特性，也提高了稳定性[3]。至此，绿色荧光蛋白GFP的应用已基本成型与完善。