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摘 要：本实验是在安琪酵母中提取酵母，配制YPD培养基采用梯度稀释接入培养基进行活化，条件为30℃，24 h。接着进行初选，然后采用划线培养进行酵母显微镜检测。将酵母接种到液体YPD培养基进行扩大培养，条件30℃、150 r/min、培养24 h，采用上一届的关于酵母的生长曲线的作图分析，选取处于对数期的酵母进行下一步的操作。用不同浓度的 H2O2 溶液刺激酵母菌1 h，离心后破碎酵母，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测并分析，通过生物信息学研究了Hsp70蛋白的氨基酸序列和二级结构。9065
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关键词：酵母；梯度稀释；H2O2 刺激；序列分析
Activate the expression of HSP70 protein in yeast
Abstract：This experiment was from Angel , preparating YPD medium ,and employed gradient dilution in order to activate yeast with the condition of 30℃, 24 h.Followed by primaries, and tested for yeast with microscope after streak cultivation. Yeast was inoculated to liquid YPD medium for expanding cultivation and cultivation condition was 30℃, 150 r/min, 24 h. According to the previous drawing on yeast growth curve analysis ,selected yeast what is logarithmic phase to be what to do next. We take measure of stimulating yeast with different concentrations of H2O2 solution for 1 h, centrifuging , smudging cell then using polyacrylamide gel electrophoresis for detection and analysis. Studied by bioinformatics Hsp70 protein's amino acid sequence and secondary structure.
Key words：Yeast; Gradient dilution; Hydrogen peroxide to stimulate; Sequence analysis
目 录
摘 要 4
引言 4
1. 材料和方法 5
1.1 实验材料 5
1.2 试验方法 8
1.3用不同浓度的H2O2溶液刺激酵母 10
1.4 酵母细胞的破碎 10
1.5 凝胶电泳检测 11
2. 结果与分析 12
2.1酵母菌的活化结果 12
2.2酵母菌的初筛结果 12
2.3酵母菌的鉴定 13
2.4 细胞破碎检测凝胶电泳 13
2.5 凝胶电泳 14
2.6 Hsp70蛋白的序列分析 14
3. 结论 17
4. 小结及展望 17
参考文献 18
致谢 20
酵母HSP70蛋白的激活表达 引言
Hsp70 家族是细胞内一类高度保守的分子伴侣蛋白，可以与其它分子伴侣共同参与多种重要的生命活动，如非天然多肽的折叠、多聚体的组装、细胞器蛋白的转运及错误折叠蛋白的降解等[1]。分子伴侣是进化上非常保守的一些蛋白质家族，广泛分布于各种生物体内，由于分子伴侣能够防止未折叠的蛋白质变性和促进聚集的蛋白质溶解复兴，所以在细胞经受高温或其他胁迫时特别重要，因而许多分子伴侣在生物体内首先以HSP形式被鉴定出来[2-4]。HSP70 作为分子伴侣参与所有细胞内蛋白质的从头合成和定位、蛋白质的成熟和错误折叠蛋白质的降解及调节过程[5-10]。
HSPs 赋予细胞或生物从各种应激中恢复的能力和保护它们免遭这些应激因素的损害。其中，表现最为明显的是热耐受能力的形成 。在热耐受的形成中 ，主要是HSP70 起主要作用 ,一系列试验表明[11]，HSP70 的表达增加或降低，细胞的热敏感性将改变。另有关研究表明，HSPs 在D N A 受损而发生凋亡的细胞中，其细胞内HSP70 水平较正常二倍体细胞明显减少，而细胞核内的HSP70 水平有所增加，说明HSP70 能够保护细胞内重要遗传物质[12]。本试验通过对特征性应激蛋白基因HSP70 的研究，来分析经不同浓度H2O2 溶液应激前后，酵母中HSP70 基因表达状况的变化。