植物表达载体的构建及转GASBD2基因马铃薯植株的获得(2)

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1 　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株

pET28a-GASBD2质粒、质粒pBIN19/SBD2和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105 (具有利福平抗性)为本实验室保存。

1.1.2　酶与试剂

头孢霉素(Cefotaxime, Cefo)；利福平(Rifampicin, Rif)；NcoI酶；BamHI酶；CTAB 抽提液（1.4M NaCl，2% CTAB， 20 mM EDTA，100 mM Tris-HCl）；β-巯基乙醇；氯仿（异戊醇(24:1)混合液）；异丙醇；Taq酶

1.1.3　植物材料

马铃薯栽培品种Desiree的无菌苗

1.1.4 培养基

LB 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2。

预培养基(M1)：MS (Murashige-Skoog)培养基 + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA；共培养

基(M2)：MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA + 100μM AS；诱导培养基(M3)：MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA +250mg/L Cefo+ 50mg/L Kan；芽分化培养基(M4)：MS + 1mg/L GA3 + 1mg/L ZT +250mg/L Cefo +50mg/L Kan；生根培养基(M5)：MS +250mg/L Cefo + 50mg/L Kan。文献综述

1.2 方法

1.2.1 植物表达载体pBIN19/GASBD2的构建

在本实验中，植物表达载体pBIN19/GASBD2用于GASBD2重组蛋白在马铃薯块茎中特异性表达。

以pBIN19/SBD2质粒[2]为基础构建植物表达载体pBIN19/GASBD2。pBIN19/SBD2质粒含有GBSSI转运肽序列和GBSSI启动子以及烟脂碱合成酶基因的终止子序列(见图1)。质粒构建的具体操作如下：用pET28a-GASBD2质粒DNA作为模板，用一对相同的引物进行NcoI-GASBD2-BamHI 基因片段的扩增。上游引物序列为：5′-TATTAGCCCATGGATTGCACCACTCCCACCGC-3′；下游引物序列为：5′-TATATAGCCGGATCCGCGCCAGGTGTCAGT-3′，其中划线的部分为NcoI和BamHI的酶切位点。用NcoI和BamHI双酶切纯化的NcoI-GASBD2-BamHI的PCR扩增片段，在pBIN19/SBD2质粒DNA的相应酶切位点中插入回收的NcoI-GASBD2-BamHI 片段，即得到植物表达载体pBIN19/GASBD2。然后提取pBIN19/GASBD2质粒DNA进行PCR 扩增检测，对PCR检测结果为阳性的质粒进行双酶切鉴定。

pBIN19/SBD2质粒的结构示意图

图 1 pBIN19/SBD2质粒的结构示意图

Fig 1 Schematic representation of pBIN19/SBD2 plasmids.

1.2.2 农杆菌的转化及鉴定

取两管农杆菌EHA105感受态细胞，冰上解冻，加入pBIN19/GASBD2质粒5μL混匀，先将样品放入进行预冷过的0.2cm 宽的电极杯中，电压2.2kV，电容25μF，电阻200 Ω，电击5 ms。取出电极杯，加入LB液体培养基800μL，转移至1.5mL离心管中。在28℃，150 r/ min的条件下振荡培养4h，然后在含有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)的LB平板上涂布，在28℃的条件下培养2-3d。提取质粒后，用一对引物5′-CGACGGCATAGCTCTGA GTGC-3′和5′-CGGATAAACTTGTACTCAAAC-3′对pBIN19/GASBD2质粒进行PCR鉴定。

1.2.3 马铃薯的遗传转化

采用优化后的遗传转化体系将马铃薯栽培品种Desiree无菌苗进行转化。先剪取长度约为1cm的马铃薯茎段，放于预培养基上，在23±1℃、16 h的光照条件下进行预培养2d。然后用OD600为0.6的农杆菌菌液侵染马铃薯茎段10 min，将茎段转移到共培养基上，在28℃、无光照的条件下进行共培养2d。共培养结束后，再将马铃薯茎段转移到含有250 mg/ L头孢霉素的愈伤诱导培养基上，在23±1℃、16 h的光照条件下进行培养，每隔10 d 就换1次新鲜培养基。约4周后将抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行诱导分化。当抗性芽长到2-3 cm时，将其剪下并转接到生根培养基上，在23±1℃、16 h的光照条件下进行生根培养[3-4]。来!自~751论-文|网www.751com.cn

1.2.4 转化植株的PCR检测