本实验采用了CTAB法[5]提取转化植株及对照植株的叶片基因组DNA。通过液氮把100 mg 新鲜的马铃薯叶片研磨成粉,加入65℃预热的CTAB 抽提液(1.4M NaCl,2% CTAB, 20 mM EDTA,100 mM Tris-HCl)500µL 和β-巯基乙醇10µL 。混匀之后在65℃水浴锅中保温30 min,加入等体积的氯仿(异戊醇(24:1)混合液)混匀,13 000r离心5 min。取上清液300µL,加入预冷的异丙醇300µL,静置20 min,13 000r离心10 min。将沉淀用70%的乙醇洗涤2次,室温下自然晾干,然后溶解于30μLTE缓冲液。
为了检测GASBD2基因有没有转入到马铃薯植株中,根据GASBD2基因的序列,用Primer 5.0软件设计一对特异性引物。引物序列为5′-CGACGGCATAGCTCTGAGTGC-3′和5′-CGGATAAACTTGTACTCAAAC-3′。预期扩增片段的大小是500bp。PCR的反应体系分别为:2μL叶片基因组DNA ,引物各1μL,2μL2.5 mM dNTPs ,2.5μL10×PCR反应缓冲液,1μLTaq酶,加双蒸水至25μL。PCR的反应程序为:95℃ 4min,95℃ 45s,52℃45 s,72℃45 s,35个循环,72℃延伸10 min。