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1.3.4 包埋法[17-18]
包埋法是将酶或细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化酶或细胞的方法。包埋法是近年来发展迅速的一种新兴细胞固定化技术，具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法。包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都比较高，且包埋在反应工程（包括反应器的设计、操作稳定性等）中应用灵活，因此，包埋法成为整个固定化生物催化剂技术中应用最广泛的固定化方法；但是包埋法的扩散阻力较大，包埋材料会在一定程度阻碍底物和氧扩散到周围介质中去，使细胞的催化活性受到限制，较适合于小分子底物与产物的反应，对大分子底物不适合。常用的包埋载体有琼脂、明胶、海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)和丙烯酰胺(ACRM)。包埋载体的性能比较理想的固定化细胞载体应该是：对微生物无毒；传质性能良好；性质稳定，不易被生物分解；强度高，寿命长；价格低廉等。以水凝胶或膜作为半透性惰性物质能允许底物的流动而限制了细胞的流动性，利用多孔性纤文质如纤文素可以使细胞渗透进入孔隙内，也能达到固定化目的，这是包埋的一种特殊形式包埋法[19]。本实验采用海藻酸钠包埋法。将细胞悬浮液与一定浓度的海藻酸钠溶液混合，再用适当浓度的氯化钙溶液将其硬化，形成海藻酸钠凝胶，工业上可用于生产酒精、啤酒、抗生素、有机酸等各种产物。
1.4 固定化细胞的应用进展
固定化细胞的优越性使其广泛应用于医药、食品、轻工业、化工、环保、能源等领域，显示出巨大的发展潜力。以下主要介绍固定化细胞在工业和环保中的应用。
1.4.1 工业上的应用
固定化细胞技术由于高性能固定载体的选择与研发、固定化细胞性能与生产条件的研究、生物反应器的研发还有待发展，因此，还处在研究阶段，还不能相应的进行大规模生产。但是，世界各国把固定化细胞研究的成果应用于生产已产生了很大的经济价值。目前在生产酒精、啤酒、氨基酸、果葡萄糖浆、苹果酸、抗生素等取得了初步的成果。1966年日本在工业上大规模利用微生物菌体生产果葡糖浆，首次取得成功[20]，并正式投入生产，之后又实现了生产连续化，取得了一系列进展。1976年，固定化细胞开始用于酒精的发酵，目前在工业生产中最成熟、最深入。最早在工业上大规模生产的氨基酸是L-天冬氨酸，Chibata等人首先用聚丙烯酰胺固定化含天门冬氨酸酶的大肠杆菌，用于从反丁烯二酸生产L-天冬氨酸，使生产成本降低40%[21]。随后，固定化技术开始广泛运用于其他氨基酸的工业生产。1996年，国内开始采用固定化细胞技术生产L-苹果酸，在生产实践中，不断完善工艺路线，使该技术逐步趋于成熟[22]。V.A.Nedovic等以海藻酸钙凝胶为载体，联合固定化Saccharomyces bayanus和 Leuconostocoenos，并用此固定化细胞来发酵苹果汁，使其转化为苹果酒。研究表明，与传统的分批发酵相比，在固定床反应器中连续的操作，可以获得更快的发酵速度，酒风的形成也能更好的控制。通过调节苹果汁在反应器中的滞留时间，可以获得或“软”（残糖高）或“干”（无糖）的苹果酒。固定化细胞还可以用于制药工业，半合成抗生素，Michael I等在流化床反应器中用固定化的镰刀菌孢子转化青霉素V为氨基青霉素烷酸(APA)，结果表明固定化镰刀菌孢子催化底物转化的收率较高，其生产能力与游离孢子相当。
1.4.2 环境保护方面的应用
近年来环境问题日益严峻，大量的废水废气的排放，早已超过自然界的自动净化能力。现在迫切需要一种绿色的处理方法来解决这些工业三废问题。细胞固定化技术开始广泛运用于这些方面，将优势菌种分离、筛选，并且固定化，能增强细胞对有毒或高渗物质的承受能力和降解能力[23]。细胞固定技术可用于处理氨氮废水、难降解的有机废水（包含印刷废水，制药废水，洗涤废水和漂白废水等）、含BOD物质废水、重金属废水、有色废水、废气等[24]。难降解的有机废水经人工固定化生物活性炭滤池对油类的去除率达到90%，去除率也高达80%，比未固定的活性炭滤池的处理效果好。杨意东等[25]针对制药行业的高浓度有机废水, 定性定量地测定了高浓度有机物底物, 筛选出降解以阿苯哒唑、扑尔敏和布洛芬为主要底物的3种优势细菌, 应用3种结合固定化材料和2种包埋固定化材料对优势菌群进行了固定化试验。李海英等[26]用PVA包埋对氯代芳香类有机化合物具有高效降解的菌群，在厌氧条件下处理含AOX的废水，结果表明固定化细胞的酶活性及AOX去除率均高于自由菌液，对温度和ph的适用范围较宽。停留时间为2.3 h 时，对造纸漂白废水去除率可稳定在65%~82%。李彤等[27]用PVA-硼酸化法包埋经富集得到的降解LAS的细菌菌系处理洗衣粉废水中的LAS, 适合条件下LAS的去除率可达90%以上。陈国成等用PVA固定化的微生物细胞去除偶氮染料的颜色，此法去除颜色很迅速，12 h能去除高浓度的染料（500 mg/L）75 ％。Heitkamp用硅藻土固定3种假单胞菌PNP1、PNP2和PNP3，置于有机玻璃柱内并通气，可成功除去废水中高浓度的对硝基酚。