④ 分别将锥形瓶中的培养基YPD(呈橘红色,有香)倒于四支50ml试管中,每支约为25ml。
⑤ 再将酵母细胞wild-type样品分别加入试管中,样品每试管500μl。
⑥ 试管置于30℃恒温暖箱振荡摇匀过夜培育。
(二)提取酵母全蛋白(Yeast protein Lysates)
① 取出过夜的试管,将其中一支25ml试管用培养基YPD稀释一倍为50ml,混匀充分后再分装到两支25ml试管。一管往酵母细胞中加入3—OH药500μl,另一管则同样加入蒸馏水500μl,用于对照。并再次放入30℃恒温暖箱振荡摇匀过夜。使酵母细胞再次生长。第二天取出。
② 移取剩余三支试管中的2ml酵母细胞用于提取其组织全蛋白,保留23ml用于提取其组织组蛋白。
③ 将酵母细胞于离心机中离心(条件:3000rpm 5min 4℃),用1ml蒸馏水洗涤细胞团块,并再次离心。条件不变。
④ 用2ml蒸馏水重悬细胞团块,分装于三支1.5mlEP管中。(其余23ml步骤相同,结束后冻存于-80℃细胞房冰箱中)。
⑤ EP管离心(条件:11000rpm 1min)。
⑥ 分别加入0.5ml 缓冲溶液A于试管中,置于涡旋振荡仪上充分振荡。
⑦ 分别加入50μl 50%三氟乙酸TCA溶液于试管中,充分涡旋振荡。置于冰上10min。
⑧ 再次EP管离心(条件:11000rpm 2min 4℃)。
⑨ 分别用0.5ml丙酮溶液洗细胞沉淀,并置于冰上5min。
⑩ 再次EP管离心。(条件:11000rpm 2min)离心完毕后,倒出丙酮溶液,并在通风橱中吹干(加药的与对照的全蛋白提取过程相同)。
(三)提取酵母组蛋白(Yeast protein histone)
① 取出冻存于-80℃冰箱中的酵母细胞,分别用1ml缓冲溶液SP重悬细胞团块,并转移到三支1.5mlEP管中。
② 配制1%SDS溶液。即在约10ml蒸馏水中加入1ml 10%SDS溶液。用于测量OD600-0.8值(也称吸光度)。
③ 测量OD600-0.8值。
④ 分别加入60μl用于破裂酵母组织细胞壁的裂解酶。
⑤ 放置于30℃恒温水浴加热。
⑥ 再次测量OD600-0.8值(要求:必须低于第一次测量结果值的10%)。
⑦ EP管离心(条件:4000rpm 5min 4℃),用1ml缓冲溶液SP洗细胞团块后,并再次离心(条件不变)。
⑧ 分别用1ml缓冲溶液NIB重悬细胞团块,放置于冰上20min。并再次离心(条件:11000rpm 20min)。
⑨ 重复第⑧步骤三次。
⑩ 分别用1ml缓冲溶液A洗涤细胞团块,并置于冰上15min,再次离心(条件:4000rpm 5min)。
⑪ 重复第⑩步骤三次。最后一次洗细胞时需置于冰上5min。
⑫ 分别用1ml缓冲溶液B重悬细胞团块,并往试管中逐滴加入111μl 0.2mol/l 硫酸溶液,于4℃冰箱旋转仪上放置过夜。
⑬ 第二天取出三支EP管,放于离心机上离心(条件:11000rpm 20min)。
⑭ 移取上层清液于三支新的试管中,分别用500μl 0.2mol/l硫酸溶液和缓冲溶液B再次提取后离心,合并上层清液。
⑮ 分别加入400μl 100%三氟乙酸TCA溶液于试管中,并置于冰上30min,再次离心(条件:11000rpm 20min)。
⑯ 分别用1ml丙酮溶液洗细胞沉淀,离心(条件:11000rpm 5min),并重复一次。最后倒出丙酮溶液,放入通风橱吹干。(加药的与对照的组蛋白提取过程相同)。
(四)处理样品
① 首先在试管中加入100μl Tris 8.0溶液,再加入100μl Loading buffer上样缓冲液和用于显色的溴酚蓝。
② 将加过溶液的试管放于恒温孵育器上煮蛋白约30min。(过程包括三次加热过程,三次冷却过程)。
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