③ 所有蛋白样品必须冻存于-80℃细胞房冰箱中。
(五)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
① 搭好装置后,按照配方配制分离胶。配置完毕后,从装置中的玻璃板中灌入分离胶,用异丙醇封胶。静置凝固约30-45min。(同时可做另一块胶)。
② 凝固完毕后,仔细倒掉上层的异丙醇,灌入事先配制好的浓缩胶。迅速插入15孔上样梳。静置凝固约30-45min。
③ 拆下玻璃板,装入电泳槽的夹板中。用力固定安插,以免上样缓冲液从缝隙中漏出。倒入上样缓冲液至刻度。并小心拔出梳子。
④ 用针头依次清洗孔中可能残余的胶丝后即可上样。
⑤ 上样结束后,接通电源与电泳槽之间的电路,设置电压100V,时间20min。
⑥ 看到标准物Marker出现红色条带时,改变设置电压150V,时间60min。
⑦ 电泳结束,取出电泳槽的夹板,取下上面的玻璃板,小心仔细地将其中一块胶放入染色碟中,用清水冲洗。
⑧ 随后加入固定液固定30min。同时将另一块胶取出放入转膜盒中准备转膜。
⑨ 将固定液倒入回收桶中,倒入考马斯亮蓝染色液染色,并且使染色液完全将胶覆盖住。
⑩ 最后放置于在摇床上振荡过夜。
(751)Western blot蛋白质印迹法
① 在转膜盒中倒入转膜缓冲液,随后放入转膜夹板,依次按照顺序放入一张厚滤纸,胶,一张NC膜,再用一张厚滤纸完全覆盖住。最后用力合上夹板夹紧。放入转膜槽中。
② 在转膜槽中的空档中放入降温使用的冰块。将转膜盒中的缓冲液全部倒入转膜槽中。
③ 接通电源与转膜槽的电路,设置电压100V,时间90min。
④ 转膜完毕后,将NC膜取出放入染色碟中,用丽春红染色液染色,可见明显清晰蛋白条带。
(七)免疫反应
① 用清水冲洗掉染色液后,加入封闭液牛血清蛋白BSA封闭膜1小时。
② 倒掉封闭液,将膜转移入封闭盒中,孵一抗H3-HRP。其可用于调整上样量。而一抗(乙酰化)则与膜上的蛋白质抗原结合。并放于4℃冰箱的摇床上振荡过夜。
③ 第二天取出封闭盒,回收一抗。用1%PBST溶液洗膜4-5次,每次5min。
④ 洗膜结束后,孵二抗(3—OH)1小时。其可用来放大一抗的信号。
⑤ 倒掉二抗,再次用1%PBST洗膜4-5次,每次5min。
⑥ 洗膜完毕,准备进行曝光。
(八)发色曝光(化学发光)
① 打开计算机和Image J 图像曝光软件,等待曝光仪冷却到-25℃,并设置好各种软件参数。
② 将1ml曝光液A和1ml曝光液B充分混合于膜上,并使膜完全被曝光液覆盖。
③ 把膜放进曝光仪进行曝光,调整对比度和亮度,使图像更为清晰,最后得出蛋白条带图像。
4 结果与讨论
4.1 分离所得组蛋白条带结构鉴定
M WT1 WT2 H2O 3-OH M M WT1 WT2 H2O 3-OH M
图(1)丽春红染色组蛋白条带—H3-HRP抗体 图(2)丽春红染色组蛋白条带—3-OH抗体
丽春红是一种可逆的大红色染色液,即用清水漂洗之后它可褪色。它可用来显示从胶上转移到膜上的蛋白条带。当蛋白质印迹法Western blot实验结束后,将NC膜从转膜槽中取出,用丽春红染色液进行染色,相应的蛋白条带即刻会显示出来,在摇床上经过3-5min后,用清水洗去颜色,最后进行图像扫描。可从图像中得出,组蛋白条带一般都在对应的20Kda-15Kda之间出现,而其他的条带属于杂带,可不用深入研究分析。图(1)所用的H3-HRP主要是争对组蛋白结构中的一类H3结构的抗体,它属于一抗(primary antibody),它并不需要再孵二抗体,便可直接曝光。而图(2)所用3-OH抗体属于二抗(secondary antibody),用于放大与NC膜上的抗原结合后的一抗的信号。所以,它在使用此抗体之前,必须先用对应的一抗结合膜上的蛋白。而此实验中使用的一抗是兔抗。(anti-rabbit)。一般情况下,每张膜使用的抗体量约为6ml。
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