线粒体转录因子A超表达载体构建及鉴定(2)

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2.1 mtTFA基因扩增结果 6

2.2 PEGFP-C1质粒和mtTFA基因的双酶切结果 7

2.3 PEGFP-C1-mtTFA转化菌落PCR鉴定结果 7

2.4 PEGFP-C1-mtTFA质粒双酶切鉴定结果 8

2.5 PEGFP-C1-mtTFA重组质粒测序结果 8

3 讨论 9

参考文献 9

前言

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，以下简称肝癌）在我国属于发病率、死亡率均较高，并有逐年增加趋势的疾病。但是目前抗肝癌的化疗药物的疗效不是很理想，这一严峻形势是得临床上对于新的具有抗肝癌潜力的化合物产生了迫切的需求。本实验的前期研究发现甲基化放线菌素D对肝癌细胞具有很强的增殖抑制活性，同时对正常细胞的毒性比较低，药理学发现，甲基化放线菌素D能够下调肝癌细胞中线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，mtTFA）的表达[ ]，提示mtTFA很可能为肝癌的治疗提供新的靶点。

线粒体转录因子A[ ]是HMG（High mobility group）蛋白家族的成员，它是核基因组编码产物。它参与了线粒体DNA转录激活[ ]，调节了线粒体DNA的拷贝数。mtTFA是由核基因编码的，并且被转入了线粒体内，发挥调节作用。除了有转录激活作用之外[ ]，mtTFA也参与了维持线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数[ ]，改善了线粒体功能还调控了肌浆网钙ATP酶的表达[ ]，它也可参与细胞的凋亡，而且对人的寿命以及疾病产生很大的影响[ ]，例如甲状腺功能的减退性肌病和线粒体脑病等等[ ]。研究还发现了在细胞核内mtTFA也可发挥作用[ ]，提示核以及线粒体基因表达调控的机制上存在偶联或协同作用[ ]。mtTFA[ ]总长大约有25kD，包括很多个功能结构域；N端的线粒体基质定位信号（matrix-targeting sequence, MTS），当转运到线粒体后，靶向序列被切除，它的中部包括两个由约80个氨基酸组成的HMG box DNA 结合的结构域，它的特性是具有非特异性结合的DNA，C末端中富含酸性氨基酸的尾部（Tail），它的特性是具有特异性的DNA结合和转录激活[ ]，mtTFA可以通过这个结构域，同其他的转录因子（如mtTFB2）相互作用[ ]。这说明mtTFA在编码靶向线粒体和核的不同蛋白质[ ]，或许对于线粒体生物发生期间协调核，线粒体的基因组的正确调控有重要的作用[ ]。

在肿瘤细胞中，mtTFA 是线粒体转录和复制关键的激活子，它能够特异性识别并且结合损伤的mtDNA[ ]，参与了细胞凋亡，对于肿瘤细胞也产生了影响；另外，mtTFA 的过表达常常也可以通过增强肿瘤的相关因子的活力，来促进肿瘤的发生、发展[ ]。有研究表明，mtTFA 同时也可以和microRNA 相互的作用，来调控着肿瘤细胞的增殖[ ]。另外，mtTFA 的低表达，可以抑制非小细胞肺癌的发生[ ]。被mtTFA 沉默的小鼠可以引起胚胎的死亡和心细胞的凋亡[ ]。可见，mtTFA 在肿瘤细胞的增殖以及凋亡的过程中有着重要的作用[ ]。

为进一步研究mtTFA在肿瘤的发生发展中的功能和作用，本实验首先构建了PEGFP-C1-mtTFA重组质粒，为深入研究mtTFA的功能奠定了基础。

1 材料与仪器

1.1 主要试剂

Trizol购自Invitrogen生物技术有限公司；限制性内切酶Xhol I和Hind III购自NEB生物技术有限公司；源`自·751.文/论:文'网,www.751com.cn DNA纯化试剂盒，质粒提取试剂盒为北京天根生物技术有限公司产品；DNA连接试剂盒，PCR试剂盒购自大连宝生物有限公司；PCR引物合成及重组质粒测序由上海英骏生物技术有限公司公司完成；DEPC购自上海生兴生物技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯。