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         （2）连接后的转化：

                  a：将连接产物加入50mL大肠杆菌感受态中，轻轻混匀，水上静置20min。

    b：将离心管放入42℃水浴锅热激1min30s。

    c：静置于冰上2min。

    d：在超净台中向每管感受态中加入700μL液体LB培养基，37℃，150rpm，震荡60min（摇床）

    e：常温下，7000rpm离心3min。

    f：在超净台上吸取700微升上清，留下菌液和菌斑，打散菌斑，吸出放置在平板上，用棒涂干为止，然后用封口膜封住。 

    g：放入37℃的烘箱培养12-16h至长出菌斑，取出放入4℃冰箱保存。

    表5  PCR试剂使用配方

    Table5  PCR reagent formulation

    编号                                试剂                             使用量

    1                            SlNAC10 PCR纯化产物                     15μL

    2                          10×PCR Buffer（Mg2+ free）                   2.5μL

    3                                MgCl2(25mM)                          1.5μL

    4                                dATP（10mM）                        0.5μL

    5                               γ-Taq酶（5U/μL）                       0.2μL

    6                                   ddH2O                              5.5μL

    表6  PCR试剂使用配方来!自~751论-文|网www.751com.cn A

    Table 6  PCR reagent formulation

    编号                            试剂                      使用量

    1                      SlNAC10 PCR纯化产物                6.75μL

    2                             PMD18-T                     0.75μL

    3                             SolutionⅠ                     7.5μL

    2.2.5 SLNAC10菌落PCR筛选阳性菌

    试剂：SLNAC10 转化长出的菌落、10xBuffer、MgCl2（25mM）、dNTPs、引物M13F/R、Taq酶、菌液、ddH2O

    方法：（1）将200mL离心管和移液枪以及白、蓝枪头放进超净台，然后开启紫外灯照射0.5h。

         （2）在超净台上操作，在200mL离心管中加入10mL的无菌水，再使用枪头挑取菌落放入无菌水中，混匀。

         （3）用移液枪吸取1mL充分混匀的菌液，加入到分装好的PCR体系（如表7）中，剩余9mL，4℃保存。

         （4）PCR程序如表8。

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