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     DNA                            5μL
        无菌水                          up to 50μL
    ② 在37℃下孵育1h。
    ③ 在65℃下放置30min使酶失活。
    ④ 用琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果(见图3-6)。
    ⑤ 割胶回收酶切产物并用琼脂糖凝胶电泳验证回收成功与否(见图3-7)。
    2.3.5 重组质粒的构建和转化
    用T4 DNA 连接酶对纯化后的GFP和pLuxR载体进行拼接,并用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收重组质粒。用纯化后的重组质粒通过一步法制备高效感受态细胞试剂盒转化DH5α和Top10F’感受态细菌,并在LB平板(含Kan)上涂布培养。
    (1)质粒拼接
    ① 反应体系:
    Linear vector DNA                 7μL
    Insert DNA                        7μL
    10×T4 DNA Ligase Buffer            2μL
    T4 DNA Ligase                     1μL
       无菌水                        up to 20μL
    ② 在22℃下孵育10min。
    ③ 在65℃下放置10min使酶失活。
    ④ 用琼脂糖凝胶电泳验证拼接结果(见图3-8)。
    ⑤ 割胶回收并再次电泳次验证回收结果(见图3-9)。
    (2)转化DH5α和Top10F’感受态细菌
    ① 用LB液体培养基(无抗性)将DH5α和Top10F’于37℃摇床培育12h进行复苏和扩增。
    ② 将菌液涂布于LB平板上(无抗性),标号:DH5α无抗、Top10F’无抗,37℃孵育15小时。
    ③ 分别挑取两平板上的菌落于LB液体培养基(无抗性),37℃摇床培养12h,用于转化。
    ④ 各取1mL两种菌液于1.5mL EP管中。
    ⑤ 4000rpm李新4~5min,彻底去除上清,再加0.1mL预冷的SSCS溶液轻轻悬浮菌体。
    ⑥ 加入5µL重组质粒。
    ⑦ 混匀DNA和细胞且在冰上放置30min,然后42℃放置90s,再在冰上房子15~20min。
    ⑧ 加800µL的LB培养基到离心管中而后在37℃,200rpm下培养1h。
    ⑨ 取100µL细胞涂布于相应抗性(同时含有Kan,IPTG、只含Kan)的LB平板上,得到4块平板:重组质粒导入DH5α(Kan,IPTG),重组质粒导入DH5α(Kan),重组质粒导入Top10F’ (Kan,IPTG),重组质粒导入Top10F’ (Kan),于37℃孵育15小时并观察结果(见表3-1)。
    2.3.6 重组质粒的验证和筛选
    由于重组质粒在拼接时两个片段有一定几率反向连接,因此我们需要筛选出连接方向正确的转化株。我们采用PCR扩增的方法,用引物gfp1031和pD1来验证其方向。引物gfp1031的序列在目的基因上,而引物pD1的序列在靠近引物gfp1031序列一端的载体质粒上,若目的基因的插入方向正确,应无法得到PCR产物,反之则说明目的基因被反向插入。我们用Top10F’的转化株来验证目的基因的插入方向。随机挑取转化株平板(含Kan)平板上的6个菌落至LB液体培养基(含Kan)37℃摇床过夜培养,然后抽提质粒,标号:1~6。以gfp1031和pD1为引物,以1~6号EP管中的质粒为模板,进行PCR扩增,参数与2.3.3相同。随后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察其结果(见图3-11、3-12)。
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