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    蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷,在电场中受力大小不同,因此跑的速度不同,根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间,离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb,利用脉冲电泳,可分离高达107bp的DNA片段。
    2.3实验方法
    2.3.1 扩大培养
    从Top10F’菌株、126菌株及117菌株的菌种EP管中挑取单菌液于5mL LB液体培养基(含Kan)中,于37℃ 、200rpm的培养箱中,培养12h。振荡试管均匀菌液,用96孔板将其稀释至107,用200μL移液枪吸取100μL稀释后的菌液于LB固体培养基(含Kan)中,于37℃的培养箱中,培养12h~15h。菌落生长到合适大小时,将平板保存于冰箱待用。
    2.3.2质粒抽提
    (1)质粒抽提
    ① 取1.5~5ml过夜培养的菌液,8000×g离心2min,收集菌体,弃尽上清。
    ② 在沉淀中加入250μl Buffer 1,彻底悬浮菌体。
    ③ 加入250μl Buffer2,立即温和颠倒离心管5~10次,室温静置2~4min。
    ④ 加入350μl Buffer3,立即温和颠倒离心管5~10次混匀。
    ⑤ 12000×g离心5~10min,将上清液移入吸附柱,8000×g离心30s,倒掉收集管中液体。
    ⑥ 加入500μl Wash Solution ,9000×g室温离心30s,倒掉收集管中废液。
    ⑦ 将Gen Clean Column重新放回收集管中,加入500μl Wash Solution,12,000rpm,室温离心1min,倒掉收集管中废液。
    ⑧ 重复步骤7一次。
    ⑨ 空吸附柱于9000×g,离心1min。
    ⑩ 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中,在吸附膜中央加入50μl~70μl Elution Buffer,室温静置1min。室温离心1min,离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液,取2~5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图3-1),纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存。
    (2)质粒检测
    ① 制备凝胶
    称0.3g琼脂糖,放入250 mL三角瓶内,加入30mL 1×TAE电泳缓冲液,加热煮沸等其凉到60℃左右,加入0.5μL溴化乙锭(EB)轻轻摇荡倒入封好的电泳板上。
    ② 放胶
    取出凝胶,放入电泳槽内。
    ③ 上样
        吸取5uL质粒,加入2μL上样缓冲液(Loading buffer)、4μL超纯水,混匀。
        将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中。
    ④ 电泳
    连接好电泳槽和电泳仪,以100V恒压电泳。电泳35min后,关上电泳仪。
    ⑤ 结果观察
    将凝胶放到紫外灯成像系统下观测,记录观察到的电泳条带(见图3-1)。
    (下文中若无特别说明,所提到的电泳验证皆按以上步骤操作。)
    2.3.3 绿色荧光蛋白GFP的扩增
    由于质粒pLuxGFPuv2上只有GFP片段的前端有AatⅡ限制性内切酶的酶切位点,要将GFP片段完整地从质粒上切割下来并接入pLuxR质粒,我们需要人为地给GFP片段加上一个AatⅡ限制性内切酶的酶切位点序列。因此,我们采用PCR扩增的方法,扩增该质粒上的GFP片段,并特别为其订购了一对引物,其中一个引物上含有AatⅡ限制性内切酶的酶切位点序列,这样PCR后所得到的GFP片段的两端将分别带有一个AatⅡ限制性内切酶的酶切位点。
    以pLuxGFPuv2为模板,以gfp1031f(一端含有AatⅡ限制性内切酶的酶切位点)、gfp2841r为引物,对该质粒的GFP片段进行扩增。具体操作如下:
    ① 在超净工作台上,冰浴,在1.5ml EP管中加入下列物质,并混匀。
     10×PCR buffer(Mg2+)              30 µL
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