② 称量凝胶的重量,以1mg=1µL换算凝胶的体积。
③ 按照凝胶浓度,按下表提供的参数加入相应比例的Binding Buffer Ⅱ。
凝胶浓度 Binding Buffer Ⅱ
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小于或等于1% 4个胶体积
小于或等于1.5% 5个胶体积
小于或等于2% 6个胶体积
大于2% 7个胶体积
④ 置于50~60℃水浴中10分钟,使胶彻底融化,加热融胶时,每2分钟混匀一次。
(当所需要的DNA片段小于500bp或大于4kp时,需要在不同浓度凝胶的融胶液中加入一个胶体积的100%的异丙醇混匀。)
⑤ 将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2分钟。8,000rpm室温离心1分钟。
(如果融胶吼的总体积大于700µL,可以加样2次以上进行分别离心。)
⑥ 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管中,加入500µL Wash Solution,8,000rpm室温离心1分钟。
⑦ 重复步骤6一次。
⑧ 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管中,12,000rpm室温离心2分钟。
(将离心立新后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50℃干燥5分钟,或自然晾干10分钟,有助于酒精的会发,提高DNA的洗脱效率。)
⑨ 将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL离心管中,在柱子膜中央加40µLElution Buffer放置5分钟。
(将Elution Buffer加热到60℃或者直接将Elution Buffer加入到 UNIQ-10柱中后60℃温育5分钟,有助于提高DNA的洗脱效率;也可以用双蒸水,用1M的NaOH将pH值调节到8.5后,再60℃洗脱。)
⑩ 12,000rpm室温离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳验证是否回收到DNA片段(见图3-4)。
(下文中若无特别说明,所提到的割胶回收皆按以上步骤操作。)
(3)载体质粒PLuxR的酶切
① 反应体系:
AatⅡ 2μL
10×Buffer Tango 2μL
DNA 5μL
无菌水 up to 20μL
② 轻柔地翻转几秒,使反应液混合均匀。
③ 在37℃下孵育5h。
④ 在65℃下放置20min使酶失活。
⑤ 用琼脂糖凝胶电泳验证(见图3-5)。
(4)pLuxR的去磷酸化处理
① 反应体系:
Alkaline Phosphatase 2μL
10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL
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