转录因子GmMYB91过表达及其对大豆耐盐能力的影响研究(2)

菜单

盐胁迫是一类主要的非生物胁迫（其他包括干旱和洪涝），它使农作物得品质和产量下降。盐胁迫改变了植物细胞内离子的种类和离子浓度，并且改变了正常的细胞代谢活动，这个改变是通过损伤蛋白质、脂质、核酸等植物细胞组分来造成的，导致植物被伤害，更严重的后果是致使植物死亡。盐害对大豆的伤害主要体现在两方面：一是影响大豆萌发，早在1964年Abel[4]等人就利用6个不同的大豆品种，设置了6个不同的浓度进行试验，结果发现，盐分降低了所有品种的发芽率和出苗率。另一方面是大豆的产量也会受到影响，比如在Abel的研究中，他指出，给植物的生长环境加盐会导致植株高度和干物重降低，植物的百粒重和产量也相应下降。除此之外，Weil(1986)[4]等曾报道，含盐量也能降低大豆品种的株高和小叶数量，而敏感的品种所受影响则大于耐盐品种。

盐胁迫下，植物体内主要生理过程都会受到影响[5]，例如光和作用、蛋白质合成、能量和油脂代谢等。总体来说，盐胁迫对植物的破坏作用主要是通过渗透胁迫、离子毒害、营养失衡以及盐胁迫引起的次级反应如氧化胁迫等过程来实现[6]。植物抗氧化系统在植物抵御盐胁迫中也有重要作用[7]。盐胁迫下，大豆幼苗POD和SOD活性随着盐浓度的增加有逐渐上升的趋势[8],大麦中耐盐的大麦品种根系会比盐敏感品种在盐胁迫下有更多活性蛋白的清除,水稻中，耐盐性强的品种也会比盐敏感品种表达更多的抗坏血酸过氧化物[9]。有研究发现抗逆性强的品种具有更强的渗透调节能力和离子去除能力[10]，增强了逆境下植物的生存和恢复能力。

转录因子是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合的一类蛋白通过与启动子区域的结合 ,它能激活或抑制下游基因在特定时间和空间的转录与表达[11]。转录因子有4个功能区，分别是DNA结合区、转录调控区、核定位信号区和寡聚化位点。通常根据DNA结合域来进行转录因子的分类，这个DNA的结合域保守性较强。

植物中的MYB结构域是氨基酸肽段。在 MYB 蛋白中含有 1~3个串联的、不完全重复的MYB结构域(R1、R2 和 R3), 每个MYB结构域折叠成螺旋-转角-螺旋(HTH)的形式参与与DNA大沟的结合[12, 13]在植物R2R3-MYB转录因子中，R3MYB结构域的第一色氨酸经常被亮氨酸、异亮氮酸或苯丙氨酸所取代。其次，一些高度保守的氨基酸存在于色氨酸前后。MYB 基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用[14,15]；对MYB转录因子基因LHY和CCA1的研究结果显示，它们可能通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控[16]。在植物体内，MYB转录因子功能多种多样，而且数量非常庞大。该类转录因子参与植物的苯丙烷代谢途径，类黄酮化合物在次生代谢途径过程中中产生。

1. 材料与方法

1.1材料、菌株、载体

本实验供实大豆品种为Union85140盐敏感大豆，由中国农科院作物科学研究所邱丽娟研究员惠赠。限制性内切酶和pMD18-T载体；RNA提取试剂TRNzol；发根农杆菌株K599。

1.2实验方法

1.2.1 大豆总RNA的提取

从植物组织中提取总RNA从而获得高质量的RNA是进行PCR，Northem杂交分析，建立cDNA文库等分子生物学研究的基本前提。植物总RNA的提取目前有许多方法，如热酚法[17]、CTAB法[18、19]、异硫氰酸胍法[20]和Trizol法等。我们使用Trizol法来提取总RNA。

1）实验原理：Trizol内含异硫氰酸胍，在异硫氰酸胍的作用下能迅速地破碎细胞，从而抑制细胞释放的核酸酶，是一种新型的总RNA抽提试剂。在剂异硫氰酸胍作用下细胞破裂，蛋白质变性，释放出核酸。释放出的RNA由于在特定PH下的溶解性不同，而分别在整个体系的水间相和水相，从而得以分离。再经过有机试剂的抽提，乙醇的沉淀，最后得到纯净的RNA。