转录因子GmMYB91过表达及其对大豆耐盐能力的影响研究(3)_毕业论文

　

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2）实验步骤：准备实验需要用到的大豆根，研钵，1.5ml Eppendorf管，进口Tip枪头备用。准备1g洗干净的大豆根，置于研钵中研磨，研磨成粉末后可以停止研磨，否则继续研磨。立即将粉末转入1.5ml Eppendorf管，加入1ml Trizol , 12000r/min,离心5分钟。加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置10min。静置后，4℃，12000r/min,离心5分钟。把离心好的上清夜转移到新的Eppendorf管，将异丙醇加入此管（0.6ml），混匀后室温下静置。静置后的液体，4℃，12000r/min,离心10分钟，弃上清，加入1ml 75％的乙醇，温和震荡，悬浮沉淀，8000 r/min,离心5分钟，弃上清。室温晾干，用50μL DEPC处理水、TE缓冲液或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃ 6min。存于-80℃超低冰箱中保存。

1.2.2 cDNA克隆

cDNA克隆从由DNA互补的反转录合成的基因转录产物开始，接着将重组载体cDNA克隆，重组，筛选，以获得的cDNA的单分子克隆产物的一项分子技术。

1）原理：MRNA从真核生物的组织或细胞中提取的是在cDNA的合成的第一个步骤，接下来利用逆转录产生碱基互补的mRNA第一链为模板来复制第二链，前提是去除mRNA的表达。双链cDNA制备成功后，可插入到质粒中去，该cDNA中不包含内含子的组成和其他调节序列，cDNA是反转录的DNA，通过mRNA。合成的cDNA通过PCR扩增，并克隆到合适的载体。

2）试验步骤：在PCR管中配置下列混合液

Oligo dT Primer(50μM) 1μL

dNTPMixture(10Mm each) 1μL

Total RNA XμL

RNase free dH2O Up to 10μL

在PCR仪上按65℃，5min，进行变性、退火反应，冰上急速冷却。

在上述的PCR管中配置下列反转录反应液，其体系为：

上述急速冷却的反应液 10μL

5×PrimeScript™ Buffer 4μL

RNase Inhibitor(40U/μL) 0.5μL

PrimeScript™RTase 1μL

RNase free dH2O 4.5μL

总体系为20μL，接下来在PCR仪上按42℃，60min;70℃，15min;4℃ 条件进行反转录反应。cDNA产物置于-20℃保存。

在Uniprot蛋白质数据库搜索MYB91，复制蛋白质序列到Primer5上,源^自(751:文,论)文]网[www.751com.cn，再将Primer5上的序列输入到NCBI的基因库中查找大豆的MYB91基因序列信息，进行Blast比较，得到其编码序列。复制编码序列到Primer5,设计与保守区两端相对应的一对引物F 和R，以上述cDNA为模板，以94℃，5min; 94℃,30s，59℃,30s，72℃,2min,30个循环; 72℃，10min为反应条件在进行PCR仪上进行扩增。PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳。切下目的片段于1.5ml离心管中做胶回收。回收的DNA片段保存于-20℃。

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