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2.4 ISSR-PCR扩增及检测 11
2.5 ISSR-PCR反应体系单因子试验 11
3 结果与分析 12
3.1 正交试验结果分析及反应体系确定 12
3.2 ISSR反应体系的优化 13
3.2.1 不同Mg2+浓度对ISSR扩增的影响 13
3.2.2 不同dNTP浓度对ISSR扩增的影响 13
3.2.3 不同引物浓度对ISSR扩增的影响 13
3.2.4 不同模板DNA浓度对ISSR扩增的影响 14
3.2.5 不同Taq酶浓度对ISSR扩增的影响 14
4 讨论 16
4.1 牡丹叶片DNA提取 16
4.2 牡丹ISSR-PCR反应体系 16
致谢 18
参考文献 19
1绪论
1.1 背景和意义
1.1.1 牡丹背景介绍
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)原产于中国西部秦岭和大巴山一带山区，是我国特有的木本名贵花卉，素有"国色天香"、"花中之王"的美称[2]，长期以来被人们当做富贵吉祥、繁荣兴旺的象征。牡丹以洛阳牡丹、菏泽牡丹最富盛名。牡丹根皮入药，名曰“丹皮”，可作为盆景植物观赏，花朵颜色众多，有粉色，红色，白色等等，粉色以粉中冠，白色以景玉较为出名。
许多来自中原、西北等品种群的牡丹品种不能很好的适应上海夏季湿热的地理和气候特征，生长状况不良，观赏品质下降。而采用传统杂交方法培育高观赏性的耐湿热牡丹新品种，其周期又非常漫长。因此，如何高效地进行上海适生的牡丹种质资源创新研究成为一项非常紧迫的工作。
1.1.2 研究目的和意义
本论文是《牡丹遗传连锁图谱构建》的一部分内容。该项目首次综合应用分子标记技术构建牡丹第一张分子遗传连锁框架图，为牡丹重要性状的基因定位、克隆和分子标记辅助育种研究奠定基础。
ISSR技术其扩增结果易受Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA等因子的影响。因此，在将该技术应用于一种植物材料的研究之前，应先建立一个合适的ISSR-PCR反应体系，以期获得可靠的结果。正交实验设计具有均衡分散、综合可比及效应明确等特性，既减小了试验规模，又不使消息损失的太多，克服了单因素试验顾此失彼、试验规模巨大的特点，从而更快找到最优水平组合。而本论文的主要内容是通过正交实验设计和优化的ISSR反应体系、以及筛选出的多态性引物，为杂种后代的多态性分析和图谱构建奠定基础。
1.2 常用分子标记
1.2.1 分子标记的简介
分子标记技术可从 DNA水平上检测生物体的遗传多样性，不受基因表达和环境条件的影响，其操作简单快速，易实现自动化，广泛应用于植物遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等方面[3]。分子育种在牡丹中的应用倍受关注.分子标记辅助育种具有快速准确不受环境条件干扰的优点,可以利用与目标性状紧密连锁的分子标记在苗期阶段进行选择,从而大大提高育种速率,加快育种进程。分子标记辅助选择育种的技术关键是与重要性紧密连锁的DNA分子标记的鉴定。
分子标记（DNA molecular marker）是20世纪80年代发展起来的，它是以个体间的DNA多态性为基础，是遗传多态性在DNA水平上的直接反应。与形态标记、细胞学标记和生化标记比较，DNA分子标记不受组织特异性、发育阶段、环境等因素影响，并具有数量大、多态性高、遗传稳定等优势，已经广泛应用于遗传育种、基因定位、分子标记辅助育种等分子生物学领域。