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2.3 ISSR-PCR反应体系的正交试验
以‘凤丹’和‘太阳’的混合DNA为模板，稀释成60ng/μl，采用L16(45)正交试验，对Mg2+(1.250、1.875、2.500和3.125mmol•L-1)、dNTPs(100、150、200和250μmol•L-1)、TaqDNA聚合酶(0.5、1.0、1.5、2.0U)、引物(0.2、0.3、0.4和0.5μmol•L-1)以及模板DNA浓度（30、60、90和120ng）进行5因素4水平筛选。根据表2-2制备20μl的PCR反应体系，除表中变化因素外，每管中还含有10×PCRbuffer 2.0μl，不足体积用无菌双蒸水补足[16]。选用ISSR正交引物进行试验。各影响因子浓度梯度见下表，正交试验设计见表2-3。
表2-2 牡丹ISSR-PCR反应的主要影响因子浓度梯度
Table 2-2 Factors and levels of ISSR-PCR reaction
浓度梯度concentration gradient Mg2+/ mmol•L-1 dNTPs
/μmol•L-1 Taq DNA聚合酶
Taq DNA polymerase
/U 引物
Primers
/μmol•L-1 模板DNA
Template DNA/ng
1 1.5 100 0.5 0.25 10
2 2.0 200 1.0 0.50 20
3 2.5 300 1.5 0.75 30
4 3.0 400 2.0 1.00 40
表2-3 牡丹ISSR-PCR 反应体系的正交试验设计表L16(45)
Table 2-3 L16(45) orthogonal design diagram for ISSR-PCR reaction system in paeonia suffruticosa
编号
Code 因 素Factors
Mg2+/ mmol•L-1 dNTPs
/μmol•L-1 Taq DNA聚合酶
Taq DNA polymerase
/U 引物
Primers
/μmol•L-1 模板DNA
Template DNA/ng
1 1.5 100 0.5 0.25 10
2 1.5 200 1.0 0.50 20
3 1.5 300 1.5 0.75 30
4 1.5 400 2.0 1.00 40
5 2.0 100 1.0 0.75 40
6 2.0 200 0.5 1.00 30
7 2.0 300 2.0 0.25 20
8 2.0 400 1.5 0.50 10
9 2.5 100 1.5 1.00 20
10 2.5 200 2.0 0.75 10
11 2.5 300 0.5 0.50 40
12 2.5 400 1.0 0.25 30
13 3.0 100 2.0 0.50 30
14 3.0 200 1.5 0.25 40
15 3.0 300 1.0 1.00 10
16 3.0 400 0.5 0.75 20
2.4 ISSR-PCR扩增及检测