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    太阳牡丹(如图2-2),植株中等,株形直立。茎黄绿色,中型长叶,顶小叶突尖,黄绿泛红,叶脉明显,叶背光滑,幼叶颜色黄绿,叶柄长37㎝,斜展,青绿色,凹处红色,花蕾圆尖型,花朵侧开,荷花型,火红色,房衣紫色,柱头红色,花丝紫红色,花瓣基部有红晕,浓香型,花径21×9㎝,中开品种。结实力强,分枝力中,一年生枝长41㎝,吐芽少,生长势中。太阳,是日本品种。
         图2-1 牡丹品种—凤丹                     图2-2牡丹品种—太阳          
    Fig. 2-1 Paeonia suffruticosa Andr. Variety--P.ostii   Fig. 2-2 Paeonia suffruticosa Andr. variety -- Tai Yang

    实验用的Lambda DNA、Taq DNA聚合酶、dNIPs以及100bp DNA marker(100-1000、1200、1500、2000、3000bp)购自TaKaRa公司。ISSR引物由上海生工生物技术有限公司合成。
    实验中使用的主要仪器有Eppendorf 5810 R型高速冷冻离心机、DYY-6C型电泳仪(如图2-4)、PTC-100TM型PCR仪(如图2-3)、JS-380型凝胶成像分析仪(如图2-4)。
     
    图2-3 PTC-100TM型PCR仪
    Fig. 2-3 PTC-100TM PCR instrument
     
    图2-2 JS-380型凝胶成像分析仪和DYY-6C型电泳仪
    Fig. 2-2 JS-380 gel imaging analyzer and DYY-6C type electrophoresis apparatus
    实验中还涉及到化学药品的配制,例如EDTA、Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)等。
    实验中EDTA(0.5mol/L,PH8.0)的配制:
    将186.1g二水乙胺四乙酸二钠(EDTA-Na•2H2O)加入800ml水中,在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节溶液的PH值至8.0(约需20gNaOH颗粒定容至1L)。分装后高压蒸汽灭菌。EDTA-二钠盐需加入NaOH将溶液的PH值调至接近8.0时,才会溶解。
    TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量(TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量),且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%,电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果,此外,回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小,长时间电泳(如过夜)不可选用,除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
    表2-1 实验中缓冲液的配制
    Table 2-1 Preparation of buffer solution in the experiment
    缓冲液    工作液(稀释液)    储存液(母液)
    Tris-乙酸    1×    50×
    (TAE)    40mmol/L Tris-乙酸    242g Tris碱、57.1ml冰乙酸<!>
         1mmol/L EDTA    100ml0.5mol/L EDTA(PH 8.0)

    2.2 牡丹基因组DNA的提取与检测
    参照王佳等[12]方法,牡丹基因组总DNA提取(大量)采用CTAB微量法(4%CATB;100mmol/LTris-HCL(pH8.0);50mol/LEDTA;1.5mol/LNaCl;2%PVP;4%β-硫基乙醇)。所提模板DNA 的质量采用琼脂糖凝胶电泳法检测。
    DNA的提取方法:①称取嫩叶片2g左右;②加液氮研磨(迅速);③迅速转入15mlEP管中(约3ml左右),加入5ml 4×CTAB(共加5次)(65℃致热30min,其中含200μl β-硫基乙醇);65℃保温30-60min。期间不断颠倒摇匀;④冷却至室温,加入2.5ml的氯仿;异戊醇(24:1)+2.5ml饱和酚轻轻摇匀(5min左右),于4℃1000r/min离心10min(反复3次);⑤移上清液至新管(动作轻缓),加10ml的遇冷无水乙醇,加1000μl醋酸钠溶液(3mol/L),轻轻颠倒摇匀,-20℃保存40-60min;⑥4℃1000r/min离心8min,去上清液,加70%乙醇洗沉淀2次,风干(第一次:8ml;第二次:5ml),第二次:4℃1000r/min 5min;⑦加500μlTE、5μlRNase,65℃水浴30min-1h;⑧冷却至室温,-20℃保存备用。
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