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ISSR- PCR 的扩增反应实验所用ISSR引物均由上海生物工程有限公司合成, 引物序列参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列, dNTPs、buffer、MgCl 和Taq DNA聚合酶等购自TaKaRa公司。(Marker)DL2000为天为时代公司生产。PCR扩增反应用美国MJ Research公司生产的PTC"225型扩增仪。
扩增程序: 94℃预变性3min;94 ℃变性45s,45～60℃(不同引物退火温度各异)复性45s,72℃延伸90s,35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。扩增反应结束后, 将扩增产物在含有溴化乙锭(EB) 的1.5%～2.0%琼脂糖凝胶中电泳分离,DNA 分子量标记为DL2 000,以3～5V/cm的电压电泳1.5h。电泳结束后,在紫外分析仪上观察扩增条带, 并用UVP紫外自动成像仪采集图像。
2.5 ISSR-PCR反应体系单因子试验
在其它反应条件不变的情况下，研究了20ul反应体系中不同浓度Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度（表2-2）对ISSR扩增的影响。引物选取817，试验设2次重复。
3 结果与分析
3.1 正交试验结果分析及反应体系确定
牡丹混合品种的ISSR-PCR反应体系优化的正交试验结果如图3-1所示。从图中正交设计ISSR-PCR反应体系的扩增结果可以直观看出，在16个处理组合中，dNTP、引物、Mg2+、Taq DNA聚合酶以及模板DNA浓度5个影响因素组合不同，扩增效果存在明显差异。第1、2、4、7、13组合几乎扩增不出条带；第,3、5、6、11、12、14组合扩增效果较差，谱带弱且多态性低。第8、9、10组合扩增出的结果，谱带多态性也较高，但谱带强度和主带较差。第15、16组合扩增的谱带不仅多态性较好，且谱带较清晰。本试验初选第16组合进一步进行单因子试验，以优化反应体系，即0.5UTaq酶，20ng模板DNA，3.0mmol/LMg2+，400μmol/LdNTPs，0.75μmol/L引物。
图3-1 ISSR标记5因素4水平正交电泳结果(1-16号组合见表3-2，M为100bp plus)
Fig.3-1 Electrophoresis of ISSR-PCR orthogonal design (1-16,Treatment number ,treatment as showed in table1-3;M,100bp plus marker)
3.2 ISSR反应体系的优化
3.2.1 不同Mg2+浓度对ISSR扩增的影响
Mg2+通过调节Taq聚合酶的活性影响PCR扩增结果，Mg2+浓度为1.5 mmol/L和2.0 mmol/L时主带较少、较弱且稳定性较差；浓度为3.0 mmol/L时达到较好的扩增效果（图3-2）。
3.2.2 不同dNTP浓度对ISSR扩增的影响
比较了100，200，300，4000μmol/LdNTP浓度对扩增结果的影响，结果表明：在各dNTP浓度下，都能扩增出条带，但dNTP浓度较低(100、200μmol•L-1)时，扩增条带少，即信息量少，有弥散现象，且条带较弱。dNTP浓度以300、400μmol•L-1较为适宜，条带稳定且清晰（图3-3）。
图3-2 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响
1-4 Mg2+浓度1.5，2.0，2.5，3.0 mmol•L-1
Fig.3-2 The results of ISSR-PCR with different concentration of Mg2+
The Mg2+ concentration from 1 to 4 are 1.5，2.0，2.5，3.0 mmol•L-1 respectively
图3-3 dNTP浓度对ISSR扩增的影响
1-4 dNTPs浓度100、200、300、400 μmol•L-1
Fig.3-3 The results of ISSR-PCR with different concentration of dNTP
The dNTP concentration from 1 to 4 are 100、200、300、400 μmol•L-1 respectively
3.2.3 不同引物浓度对ISSR扩增的影响
图3-4 引物浓度对ISSR扩增的影响
1-4 引物浓度0.25，0.5，0.75，1.0 μmol•L-1
Fig.3-4 The results of ISSR-PCR with different concentration of Primers
The Primers concentration from 1 to 4 are 0.25，0.5，0.75，1.0 μmol•L-1 respectively