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    引物浓度对牡丹扩增结果影响也较大,在引物浓度为0.25μmol•L-1时扩增条带较少且不清晰;0.5μmol•L-1时都没有条带;在0.75μmol•L-1和1.0μmol•L-1时扩增效果较好(图3-4)。

    3.2.4 不同模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
    所选模板DNA浓度扩增效果都不错,考虑到节约用量及过低误差较大,选模板DNA浓度为20ng(图3-5)。
    3.2.5 不同Taq酶浓度对ISSR扩增的影响
    在20ul反应体系中,使用0.5,1.0,1.5,2.0U的Taq DNA聚合酶均能扩增出条带,0.5U 用量时最稳定,而1.0-2.0U用量时扩增的条带稳定性较低(图3-6)。
     
    图3-5  模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
    1-4 模板DNA浓度10,20,30,40 ng    
    Fig.3-5 The results of ISSR-PCR with different concentration of template DNA
    The template DNA concentration from 1 to 4 are 10,20,30,40 ng respectively
     
    图3-6  Taq酶浓度对ISSR扩增的影响
    1-4 Taq酶浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 U
    Fig.3-6 The results of ISSR-PCR with different concentration of Taq Polymerase
    The Taq DNA Polymerase concentration from 1 to 4 are 0.5,1.0,1.5,2.0U respectively

    从上述实验结果建立牡丹ISSR最优化反应体系为:总体积20ul, Taq聚合酶浓度为0.5U;模板DNA浓度为20ng;Mg2+浓度为3.0mmol/L;dNTPs浓度为400μmol/L;引物浓度为1.0μmol/L

    4 讨论
    4.1 牡丹叶片DNA提取
    植物材料的老嫩度对基因组DNA提取的影响很大,牡丹DNA的质量直接影响PCR反应的质量。通常情况下,嫩叶DNA提取较容易;成熟老叶因其叶中多酚、多糖等高分子物质明显增多,使得提取较高质量的DNA困难。实验表明,研磨叶片时加少量PVP(最好不溶性的)和抗坏血酸(Ve)、较高浓度的CTAB提取液等(含有4%硫基乙醇及2%PVP)均有利于去除老叶中的多糖和多酚物质。沉淀是采用异丙醇效果好于无水乙醇(嫩叶正好相反)。因异丙醇更易于沉淀小分子量物质,减少多糖等高分子物质的沉淀。DNA中的RNA消化对PCR反应的影响很小。
    本实验也发现,当采用牡丹的成熟叶片为材料时,其DNA提取的难度明显比幼嫩材料的加大,首先材料越老越难磨碎,而研磨时间太长,将导致DNA降解;其次是去除多糖、蛋白质等次生物质的难度更大。幼嫩植物材料的采摘往往受季节性的影响,有时也不得不采用相对成熟的植物组织来提取DNA,依据本实验的经验,尽管材料越老,DNA提取的难度越大,产量也越低,但仍可设法获取高质量的DNA。
    4.2 牡丹ISSR-PCR反应体系
    在该PCR反应体系中,DNA模板用量过少,引物与模板结合机率降低,导致扩增产物的稳定性下降;用量过多,又可能将模板中杂质过多地带入反应体系,导致扩增产物稳定性下降,或导致过量扩增,使电泳图谱呈弥散状[19]。通常DNA用量很小,只要够用即可,量多反而可能因杂质多而起反作用,在DNA模板不很纯的情况下,宁可使用有效浓度范围内的最低极限。本研究表明:牡丹ISSR体系具有较宽的模板用量范围,在20ng/20μl就可以扩增出较好条带,大大节约了模板用量。
    dNTP 是反应中磷酸基团的主要来源,传统的筛选试验认为dNTP的浓度过低会导致无扩增产物或扩出来的条带不清晰;浓度过高则错误掺入率增强。此外,由于dNTP直接螯合相应数量的Mg2+,它的浓度改变都会影响有效Mg2+ 的浓度[20,22]。我们在试验过程也发现当dNTP浓度低时扩增条带减少和变淡。
    PCR反应中,Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率,是ISSR-PCR 反应中的一个主要变化因素,许多植物Mg2+浓度为1.5-2.0 mM.L-1 时扩增效果较为理想 [21]。我们在研究中发现Mg2+ 浓度为1.5 mM.L-1时扩增条带较弱,这可能是Mg2+ 浓度过低而导致对Taq 酶激活作用不强的缘故。
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