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摘要第三代基因测序技术中通量最高的复合探针锚定杂交和连接技术以荧光成像方法检测基因芯片，由于光学衍射极限的存在，限制了其进一步的发展。近年来兴起的偏振参数非直观成像技术，不同于依赖于光强差成像的传统直观成像，在生物医学、军事侦察、材料科学等领域发挥着重要的应用，是对物质鉴别的一种有效手段。为突破传统方法的局限性并探讨基因测序成像新技术，本文将非直观偏振参数调制的方法应用于基因芯片荧光成像进行了研究。 理论上，根据入射光的斯托克斯矩阵表示形式，推导了以液晶相位延迟器件为偏振调制器的偏振成像计算方法。在传统荧光显微镜光路中搭建高速非直观偏振参数成像系统，通过电荷耦合器件（CCD）接收不同偏振状态下的荧光光强信息，并由 MATLAB编程计算获得荧光偏振参数图像，验证了非直观偏振调制荧光成像的可行性。最后分析实验误差来源并提出改进方案。41646
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毕业论文关键词 基因芯片 荧光成像 液晶 偏振调制
Title Study on the method of indirect fluorescent imaging on gene microarray
Abstract In the third generation of gene sequencing, combinatorial probe anchor ligation(cPAL) can sequence the largest numbers of genes, by using fluorescent microscope imaging on the gene microarray. However, its development was limited by the existence of diffraction limit. Recently, one new method called Polarization Parameter Indirect Imaging (PIMI) has been attractive to researchers for its unique imaging technique by polarization modulation and inversion calculation, which is different from the traditional imaging method based on light intensity. PIMI has been developed for several years and plays important roles in applications such as biomedical, military reconnaissance, materials science and other kind of fields, which is an effective means of method for substance identification. In this dissertation, to break the limits of conventional imaging technologies in gene microarray, a research on PIMI-based gene microarray’s fluorescent imaging is investigated. In theory, according to the polarization of Stokes matrix representation, computing and deducing has been made to deduce polarization imaging method as a polarization modulator using the phase delay device. Building high-speed polarization indirect imaging systems, using matlab program to get the polarization parameter fluorescent images according to the intensity which CCD received under different state of polarization, verifying the feasibility of polarization modulated fluorescent imaging. At last, analyzing the experimental error sources and putting forward the improvement plan.
Keywords Gene microarray Fluorescent imaging Liquid crystal polarization modulate
目次
1引言1
1.1背景简介1
1.2偏振研究现状3
1.3论文写作安排5
2偏振基本理论6
2.1偏振光的含义6
2.2偏振光的描述7
2.3非直观偏振调制荧光成像系统方案10
3系统设计与实验13
3.1器件选取13
3.2液晶测试14
3.3非直观偏振调制荧光成像17
4偏振计算与结果分析20
4.1偏振图计算20
4.2结果分析22
4.3实验误差与改进方案25
结论26
致谢27
参考文献28
附录A斯托克斯参数MATLAB计算程序30
1 引言
1.1 背景简介 自1952年发现DNA 是遗传物质， 各种关于基因的研究飞速发展，尤其是基因测序技术，如下图 1.1 所示。1977 年第一代 DNA 测序技术（Sanger 法 ）[1]出现，至今四十年时间，测序技术已从第一代发展到第四代。就目前形势看，第二代、第三代测序技术在全球测序市场上仍然占据绝对的优势地位，但第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。基因测序技术的每一次巨大改变，对人类疾病基因研究、医学、生物技术、制药工业以及社会经济等有着重要的影响作用。杂交和连接技术测序的详细过程示意图[3]。通过 PCR 过程对DNA链扩增后，使用 Phi29DNA聚合酶产生 DNA 纳米球并将其固定在硅芯片上形成纳米球阵列芯片，之后通过运用普通探针联同标准锚定序列和延伸锚定序列进行杂交和连接检测。 完整基因组学公司的 DNB 阵列生产和cPAL技术的方案示意图。 A. 所用处理过程的原理流程图。 B. 库建设原理图。r1 到r8是与独立转化器尾部毗邻的遗传DNA区域；Ad1到 Ad4 显示为转接器 1到4； C. 使用Phi29DNA 聚合酶产生DNA 纳米球和纳米阵列型式的制作原理图。 D. 组合探针锚定连接产品原理图 每进行一个杂交和连接循环就要对带有 DNA 纳米球的芯片进行荧光成像，然后用甲酰胺溶液对 DNA纳米球进行重建。这种循环被重复直到全部组合的探针和锚定序列被检测。 深圳华大基因科技有限公司是我国测序公司中名列前茅的存在，该公司以复合探针锚定杂交和连接技术为核心测序技术生产测序产品[3]。由上述可知该测序使用荧光光学的检测方法，其进一步的发展受到光学衍射极限的限制。非直观偏振参数显微成像法，能够达到低于100 纳米的超分辨率，打破光学衍射极限，并且存在达到更高分辨能力的潜力[4]。为帮助华大基因探索荧光成像进一步发展的方向，提出将非直观偏振参数调制的成像方法应用于基因芯片荧光成像并进行研究。 目前基于生物芯片的偏振研究主要以激光共聚焦仪器为主，偏振调制的荧光成像方法尚在当前所有的测序技术中，第三代测序技术处于领先地位，而第三代测序技术中使用荧光成像的光学检测方法的测序技术有两种（全基因组学公司和太平洋生物科学公司[2]） ，皆以高速和高通量测序为目的。全基因组学公司运用阵列形态各异的 DNA 纳米芯片，通过增加DNA 纳米球杂交位点的数量来增强信号强度，每个位点连接一个 DNA 纳米球。宽 1 英寸长3 英寸的硅芯片上可固定多达 30 亿的 DNA 纳米球，芯片上的位点彼此大致相隔 1 微米，这极大地增加了每张芯片上的测序片段的数量，且 DNA 纳米球的大小和间隔能够让检测器的像素使用达到最大化。所示为全基因组学公司 DNA 纳米芯片的生产过程以及完整的复合探针锚定无多少研究案例，本课题利用两片液晶相位延迟器和一片线偏振片组成的偏振调制系统用于DNBs（DNA Nano Balls）微阵列的荧光成像光路，验证非直观偏振调制成像应用于基因测序荧光成像的可行性，为后续非直观偏振荧光成像的深入研究打下基础。课题测试得到了液晶相位调制器相位延迟量曲线，并搭建偏振调制成像系统，通过 MATLAB计算出出射荧光的全斯托克斯参数等偏振图像，实现对DNBs 微阵列的荧光偏振成像。
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