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Fig. 3-3 The electrophoresis of Enzyme digestion PCR product
由于引物长度偏小，酶切之后的PCR产物（最右道）与PCR产物相比，并无多大差别。
3.7. 新质粒的构建
通过割胶回收酶切产物获得目标片段后，长片段进行碱性磷酸化处理。经过碱性磷酸化处理的长片段可以和短片段进行连接。经过多次尝试，选择长片段和短片段在体系中加入体积比例为1：3，4℃连接过夜。连接产物琼脂糖凝胶电泳验证图如下图3-5所示：
图3-5 连接产物电泳验证图
Fig. 3-5 The electrophoresis of ligation product
从电泳图中可知，改造后的野生型WT的质粒目标条带出现在5000bp左右的区域。突变型2412的质粒目标条带出现在达于5000bp的区域。根据实验方案所设计的新质粒大小，两个质粒大小分别为：野生型4597bp，突变型2412为5419bp。因此可判断，最上方的目标条带应该是目的条带。另外，从琼脂糖凝胶电泳图中还能看出，相比于各自的原质粒WT和2412的大小，WT`与原质粒WT基本持平，而2412`要小于2412原质粒，这也从侧面证明了目标条带为实验所求的条带，因为，CcdB基因大约为1000多bp，而我们后期连入代替的GFPuv2基因是878bp。因此，初步可判断连接成功，连接产物可用于转化。此外，出现在2000bp左右位置的明亮条带为GFPuv2的二聚体，属于连接正常现象，不会影响之后的转化。
3.8. 转化涂布
本次课题采用生工有限公司生产的一步制备感受态细胞溶液SSCS，将所拼的两个质粒分别转化入不含有任何质粒的野生型top10F’中，涂布，37℃下培养20h，形成单菌落。按照实验原计划设计，由于我们已将原质粒中的CcdB基因替换成GFPuv2，因此，在含有IPTG的平板上，37℃下培养20h后，两块平板上长出的单菌落会显绿色。然而，本次转化的结果并不理想，两块平板上都没有长出大片的单菌落，只有零星几个。我们分析，转化率低的原因可能是因为一开始酶切操作不过关，于是，我们重新设定反应时间，将酶切时间延长，采用过夜酶切。其他步骤不作改变。然而转化率依然很低，转化平板上未出现大量的单菌落出现。同时，凝胶电泳结果显示，质粒的确已进行正确酶切。因此，可以判断不是酶切的问题。酶切问题排除之后，我们怀疑碱性磷酸化这一步有问题。然而事实证明，我们这种分析是错误的。原因很简单：碱性磷酸酶的作用是防止长片段自连，保持其线形状态，而线形质粒是不可能转化入感受态细胞的。而我们的转化结果显示，质粒转化率极低，甚至有不长单菌落的平板。因此可以说，去磷酸化这一步没问题，甚至完成的质量很不错。最后，我们怀疑是制备感受态细胞的过程中出了问题。不含质粒的top10F’很容易染菌，一旦染菌，会导致转化失败。由于实验后期气温转暖，这种染菌的情况在实验室中很普遍，有理由相信这种情况的发生。为了排查这个因素，我们选取第一次的连接产物作为转化DNA，直接作转化。同时在作转化的同时，作一次对照。具体是，将完整的野生型原质粒转化到制备的感受态细胞中去。这样做有三个目的：其一，排查是否是top10F’的问题。其二，是否是SSCS的问题。其三，是否是转化操作的问题。这次转化的结果是，两个重组质粒依然转化失败，而野生型质粒转化成功，且转化率很高。这说明，我们在转化时使用的SSCS和top10F’没问题，操作步骤也合格。那么问题只可能出在连接这一步上。
连接这一步出问题，极有可能是连接片段的浓度不够。我们历次在连接反应体系中，均采用的长片段和GFPuv2的比例为1：3，符合连接要求。但历次转化结果暗示：实际片段浓度远远达不到连接的要求。为提高连接片段的浓度，我们曾经尝试过绕开碱性磷酸化，冒着长片段自连的风险，使用割胶回收的长片段直接同割胶回收的GFPuv2作连接，然后作转化。虽然这次转化的结果看似理想，长出了大量单菌落，但经测序，结果显示都是长片段自连体，目的基因GFPuv2并未成功转入。这说明，碱性磷酸化这一步无法舍去，提高连接片段的浓度只能通过提高割胶回收的操作质量来达到。