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3.2. 质粒基因测序寻找变异位点 16
3.3. 转座子的插入足以使突变型避免自杀 16
3.4. 抽提质粒 17
3.5. PCR产物 18
3.6. 酶切质粒和PCR产物 19
3.7. 新质粒的构建 20
3.8. 转化涂布 21
4. 结论 23
致谢 24
参考文献 25,4114
1. 前言
1.1. 细菌的群体感应
细菌群体感应（quorum sensing，QS），也称自诱导，是细菌根据种群密度大小进行细内或细间信息交流，协调群体行为，并调控基因表达的一种机制。它利用信息分子在细胞间扩散，来感知自身和周围环境中其它菌群的数量变化，当信号分子浓度达到一定阈值时就启动菌体相关基因表达，调控相关生物学功能。
群体感应信号分子为N-酰基-高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHL)。20世纪70年代，Nealson K H等在海洋细菌费氏弧菌(Photobacterittmfischeri，曾用名Vibrofiseheri)和夏威夷弧菌(Vibro haveryi)中发现了由群体感应控制的生物发光现象。在费氏弧菌的群体感应系统中，主要有两种组分参与：LuxI蛋白和LuxR蛋白。
群体感应主要有两类：种内特异和种间特异。革兰氏阴性菌利用具有不同酰基侧链的高丝氨酸内酯(acyl—homoserine lactonase，AHLs)，革兰氏阳性菌利用一些小肽作为信号分子来感知种内自身种群数量，协调多种基因的表达。还有一类信号分子是一种呋喃硼酸二聚酯，即自体诱导子2(autoinducer一2，简称AI一2)，它在革兰氏阴性菌和阳性菌中均存在，被用来感知种间细菌数量来调控细菌自身行为。另外，最近研究发现，有些细菌利用两种甚至三种不同的信号分子调节自身群体行为。
实际上，研究发现，不仅仅是单细胞细菌之间，不同的微生物菌群之间也存在着群体感应现象。研究表明，群体感应参与细菌种群竞争，孢子生成，抗生素生产，致病因子诱导，细胞分化，致病菌感染过程的营养分配以及其他许多生理反应的调控。群体感应除了参与调节微生物种群的竞争和分化外，还参与共生和竞生生物体之间的信息交流。 例如，P．aeruginosa产生的AHL信号分子可进入哺乳动物细胞，激活构建的人工转录因子，使某些真核基因得到表达。
菌群之间通过群体感应系统实现二者之间的营养竞争关系，在同一竞争生长条件下，某一菌群可以成为“优势菌群”，抑制另一“劣势菌群”的生长；而劣势菌群的锐减又会影响优势菌群的生长。
1.2. 自杀基因回路设计
基因工程线路是合成生物学的关键技术。早在2000年，Nature杂志在线发表了基因振荡和基因双稳态两个基因线路，这一直被业界认为是奠基性工作。一个典型的基因线路是基因双稳态线路，双稳态线路是由两个蛋白质编码基因与两个相对应的启动子组成。
在已经熟知的群体感应原则的基础上，本研究试图对细菌的自杀行为及其对出现突变型时的种群。但通常情况下，群体感应是非常复杂的。因此，研究急需一个基因结构简单、模式简单、易受干扰少的模式生物来当作研究细菌自杀性为的生物基础。此时，合成生物学的试验方法和手段为这一模式生物的构建提供了便捷。本实验室前期立足于细菌的群体感应原则，已成功构建了一个含有自杀基因回路的质粒，见图1-1。