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Aat II 2uL
PCR 10uL
超纯水 18uL
e. 割胶回收
1．用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。
2. 根据较快的重量和浓度，按比例加入Buffer B2。当凝胶浓度小于等于1%时，每100mg凝胶加入300 uLBuffer B2。
3. 将离心管置于50摄氏度水浴5~10分钟，直至胶块完全熔化。
4. 将熔化的胶块移至吸附柱中，8000rpm离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 uLWashing Solution，9000rpm离心30秒。倒掉收集液，将吸附柱放回收集管中。
6．重复第五步。
7．将空吸附柱空转1分钟，转速为9000rpm。
8．将柱装入干净的1.5ml离心管内，在吸附膜中央，滴入40 uLElusion Buffer，室温下静置2分钟，9000rpm离心1分钟。
9．将所得产物于-20摄氏度下保存。
f. 碱性磷酸化
本次碱性磷酸化处理，使用生工公司生产的FastAP快速碱性磷酸酶，配合Buffer Tango使用，能够快速催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端，防止与3’-OH发生缩合脱水反应，从而起到抑制长片段自链环化的目的。该酶最适反应温度为37℃，反应时间为1小时。随即在65℃下，灭活30分钟。反应体系见表2-6
表2-6 碱性磷酸化反应体系
试剂 体积
FastAP 1uL
Buffer Tango 2uL
DNA 8uL
超纯水 9uL
g. 连接
利用T4 DNA Ligase ，连接割胶回收的长片段和短片段。该酶可催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合。T4 DNA Ligase最适反应温度为22℃，连接时间为10分钟。65℃下10分钟内，该酶旋即失活。也可采用4℃为反应温度，而反应时间则需12小时。根据实际情况可自由选择反应条件。本次实验选择22℃反应温度。连接后的产物必须保存在-20℃下。反应体系见表2-7
表2-7 连接反应体系
试剂 体积
载体DNA 3uL
目标DNA 5uL
10×T4 DNA Ligase Buffer
T4 DNA Ligase 2uL
1uL
超纯水 9uL
h. 感受态细胞制备
1.取1mlOD630约0.4左右的菌1.5mL的微量离心管中。
2.4000rpm离心4～5min，彻底去除上清，在家0.1mL的遇冷的SSCS溶液轻轻悬浮菌体。
3.加入1μL用于转化的DNA。
4.混匀DNA和细胞且在冰上放置30min，然后在42℃放置90s，再在冰上放置15～20min。
5.加入0.8mL的LB培养基到离心管中，在37℃,200rpm中培养1h。
6.将离心管于9000rpm离心5min，去除800μL上清液，用剩余的培养基重悬细胞。
7.将细胞液涂布于含有卡那霉素的平板上。平板正置30min后，倒置于37℃培养箱中培养20h以上。
i. 检验转化菌
从每块平板上随即筛选751个点，扩菌，抽提质粒。利用扩增目标基因时的那对引物做PCR。如果转化菌呈真阳性，是扩增不出片段的。将筛选出来的合格的转化菌扩菌，再涂布，保存。
3. 实验结果与分析
3.1. 突变菌株的筛选和自杀过程中突变种群的蔓延
按照2.2.2中的方法，在每一个时间点取样涂布平板后随机挑选30个单菌落接种96孔板，绘制生长曲线并与阴性（wild type, no IPTG）、阳性（wild type with 1mmol/L IPTG）对照比较。以0.1 mmol/L IPTG管13.5 h的样品为例，曲线如图3-1所示。
以图3-1为例，随机挑选的30个单菌落中，有15个的生长曲线与阴性对照即不加IPTG的野生型一致，说明这些菌株不再被IPTG诱导自杀，属于突变型个体，因此确定在IPTG浓度0.1 mmol/L的样品管13.5 h的菌液中突变型比例为50%。