TB 型分析天平 浙江余姚市金诺天平仪器有限公司
BHC-1300ⅡA2型生物安全柜 苏州苏洁净化设备有限公司
ZF-90型暗箱式紫外透射仪 上海顾村电光仪器厂
FR-200A全自动紫外与可见分析装置 上海复日科技有限公司
TGL-16G离心机 上海安亭科学仪器厂
冷冻离心机 上海恒科仪器有限公司
制冰机 上海恒科仪器有限公司
YXQ-LS-30 SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
PCR仪 上海恒科仪器有限公司
酶标仪 上海圣荷西医疗用品有限公司
96孔板 浙江拱东医疗科技有限公司
24孔板
干式恒温器 浙江拱东医疗科技有限公司
杭州奥盛仪器有限公司
2.1.4. 培养基及试剂的制备
TBK培养基:称取10g胰蛋白胨,7gKCl,20.93gMOPS,溶解于1L蒸馏水中,灭菌前用HCl、KOH调pH至5.72,121℃高压灭菌30min。
LB液体培养基:称取25g LB medium Broth, 溶解于1L蒸馏水中。
LB固体培养基:称取25g LB medium Gel, 溶解于1L蒸馏水中。
IPTG100×:0.238gIPTG粉末、10mL超纯水。0.2μm滤膜过滤。
卡那霉素1000×:0.5g卡那霉素粉末、10ML超纯水。0.2μm滤膜过滤。
不同浓度3-oxo-C6-HSL:由1.75mM3-oxo-C6-HSL-甲醇溶液稀释,1.75mM 3-oxo-C6-HSL-甲醇溶液为原实验室储存液。
TAE缓冲液(1×工作液):量取10ml50×TAE浓缩液,加入到490ml超纯水中。室温保存,不必灭菌。
2%X-Gal溶液:称取2gX-Gal溶于100ml二甲基甲酰胺(DMF)中,至于阴暗处,不用灭菌,-20度保存。
2.2. 实验方法
2.2.1. 细菌扩大培养
从甘油冻存管中刮取含有pPopctrl质粒的top10F’菌株,接种于LB(含50 μg/mL的Kanamycin)培养基中,37℃、200 r/min振荡培养过夜,倍比稀释后涂布LB平板,37℃温育24 h,用接种环挑取单菌落接种于5 mL LB(含50 μg/mL的Kanamycin)培养基中,37℃、200 r/min振荡培养15 h,作为实验接种液。
2.2.2. 菌株筛选
为了鉴别不同时间点样品中的野生型和突变型,本课题利用二者生长曲线的不同区分之。具体做法是:培养过程中不同时间点取样,倍比稀释涂布90 mm LB平板,培养后从中随机挑取30个单菌落,接种于96孔板中,每孔中加200 μL TBK培养基,其中含Kanamycin和1 mmol/L IPTG,接种后每孔再加50 μL矿物油封顶以防蒸发。预留2孔,其中TBK分别含与不含IPTG,此2孔接种野生型菌株分别作为阳性、阴性对照。将该96孔板置于Plate Reader V3中30℃孵育,每隔10 min振板30 s并测定OD600,连续测定18 h以上。绘制30个孔中30个单菌落的OD-时间生长曲线,与对照孔相比较,确定其中野生型和突变型的数量。
2.2.3. 突变菌株的质粒提取和测序
为了研究突变发生的位点,在不同时间点和不同IPTG浓度的菌液样品中随机挑选6株突变菌,LB扩大培养后用试剂盒抽提质粒,电泳检测后送上海迈浦生物技术有限公司测定质粒全长序列。测序结果用Vector NTI软件与pPopctrl质粒原始序列比对。
2.2.4. 突变质粒转化不含任何质粒的top10F’菌株后的生长曲线测定
为了研究是否质粒上的突变足以使宿主逃脱群体感应自杀行为,本文选择将2个已被证实的并已测序的突变质粒重新转化到不含任何质粒的野生型top10F’宿主菌中去,构建只有质粒突变的准野生型细菌,将9 μL接种液分别接种于9 mL TBK培养基(含50 μg/mL的Kanamycin)中,培养基分别含IPTG浓度为0.01、0.05、0.08、0.1、1 mmol/L,并以不加IPTG的培养基作为对照。30℃、250 r/min振荡培养,间隔1.5~2 h取样200 μL于96孔板中先后测定OD600和CFU,绘制生长-时间曲线。
- 上一篇:车前草多糖提取工艺研究
- 下一篇:牡丹ISSR反应体系的优化研究+正交试验设计
-
-
-
-
-
-
-
大众媒体对公共政策制定的影响
乳业同业并购式全产业链...
杂拟谷盗体内共生菌沃尔...
当代大学生慈善意识研究+文献综述
中考体育项目与体育教学合理结合的研究
java+mysql车辆管理系统的设计+源代码
酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸
河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状
电站锅炉暖风器设计任务书
十二层带中心支撑钢结构...