2.2.5. 扩菌保种
扩菌:分别接种野生型和2412至LB液体培养基中(pH=5.72),培养12小时左右。
制备LB固体培养基:称取LB固体培养基,高温高压灭菌。待培养基冷却至50℃左右,按培养基总体积千分之一的比例,加入卡那霉素至LB固体培养基中,摇匀,依次浇注培养皿,制作平板。待LB固体培养基冷却凝固后,加入100nmol/LIPTG溶液20ml,和100μL2%X-Gal溶液,均匀涂抹于培养基表面,37摄氏度下烘干待用。此外准备一批平板,按以上的量,不加 IPTG,只加X-Gal,作为对照。
稀释:取12小时的菌液100μL至已灭菌的96孔板中,吸取其中20μL加入到180μL的超纯水中,稀释了10倍。以次类推,将菌液稀释到10-7。
涂布:分别吸取各稀释液100μL,涂布于制备好的平板上。待菌液被培养基完全吸收后,倒置平板与培养箱中,37℃下过夜。
2.2.6. 构建质粒LuxR-GFPuv2
a. 抽提野生型和2402大肠杆菌质粒
1. 取1.5~5ml过夜培养的菌液,8000×g离心2min,收集菌体,弃尽上清。
2. 在沉淀中加入250μl Buffer 1,彻底悬浮菌体。
3. 加入250μl Buffer2,立即温和颠倒离心管5~10次,室温静置2~4min。
4. 加入350μl Buffer3,立即温和颠倒离心管5~10次混匀。
5. 12000×g离心5~10min,将上清液移入吸附柱,8000×g离心30s,倒掉收集管中液体。
6.加入500μl Wash Solution ,9000×g室温离心30s,倒掉收集管中废液。
7. 将Gen Clean Column重新放回收集管中,加入500μl Wash Solution,12,000rpm,室温离心1min,倒掉收集管中废液。
8. 重复步骤7一次。
9. 空吸附柱于9000×g,离心1min。
10. 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中,在吸附膜中央加入50μl~70μl Elution Buffer,室温静置1min。室温离心1min,离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液,取2~5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测,纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存。
b. 质粒检测
1. 制备凝胶
称0.3g琼脂糖,放入250 mL三角瓶内,加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液,加热煮沸等其凉到60℃左右,加入0.5uL溴化乙锭(EB)轻轻摇荡倒入封好的电泳板上。
2. 放胶
取出凝胶,放入电泳槽内。
3. 上样
1)吸取5uL质粒,加入2uL上样缓冲液(Loading buffer)、5uL超纯水,混匀。
2)将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中。
4. 电泳
连接好电泳槽和电泳仪,以100V恒压电泳。电泳35min后,关上电泳仪。
5. 结果观察
将凝胶放到紫外灯成像系统下观测,记录观察到的电泳条带。
c. 扩增目标基因
设计一对引物,以117的质粒为模板,通过PCR的方法,获取GFPuv2片段。反应体系见表2-4
表2-4 PCR反应体系
试剂 体积
2×Taq酶PCR混合液 25uL
上游引物(gfp1031f) 1uL
下游引物(gfp2841r) 1uL
模板DNA
超纯水 2uL
21uL
d. 酶切
利用AatII酶,分别酶切野生型和2412的质粒,切除该质粒上的Luxbox-CcdB基因。同时,尝试利用该酶,切除PCR产物上的引物。37摄氏度下反应1小时。65摄氏度下灭活20分钟。酶切完进行电泳,检验酶切效果。反应体系见表2-5
表2-5(a) 质粒DNA酶切反应体系
试剂 体积
10×Buffer Tango 2uL
Aat II 2uL
DNA 5uL
超纯水 11uL
表2-5(b) PCR酶切反应体系
试剂 体积
10×Buffer Tango 2uL
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